如何实时、可多路共用监测细胞培养基中代谢物？
发布时间：2024-10-21 浏览次数：59
对细胞培养系统中特定代谢物浓度的高频、实时测量将有助于更深入地了解细胞代谢，并促进在细胞培养方案中应用良好的实验室实践标准。然而，目前可用的方法要么局限于单时间点和单参数测量，要么局限于可检测分析物的范围内。基于电化学适配体生物传感器（Electrochemical aptamer-based，EAB）在血液和组织体内分析物的实时监测中已经应用。在这里，作者描述了EAB传感器的pH感知能力，它独立于适配体序列的特定目标分析物。我们将这种双重用途的EAB应用于几种体外细胞培养环境中pH和苯丙氨酸的连续测量。这种开发的微型EAB传感器具有快速的响应时间、良好的稳定性、高重复性和生物学相关的灵敏度。作者还开发并表征了一种无泄漏的参比电极，它可以减轻从传统参比电极中释放出来的银离子的潜在细胞毒性效应。使用由此产生的双用途传感器，作者每小时对培养的上皮肿瘤细胞系（A549，MDA-MB-MB-23）和人成纤维细胞系（MRC-5）的培养基中的pH和苯丙氨酸浓度进行测量，持续时间长达72小时。这种可扩展技术可以被多路复用，用于pH和多种分析物的高通量监测，以支持微生理系统的广泛代谢分析。
图1 图文摘要
关键发现：
1、 EAB传感器显示了在峰值电压中与pH值相关的线性位移
图2 传感器pH测量的特征
对工作缓冲液中的适配体传感器的常规表征显示，峰值电位随pH值的变化而变化。色氨酸EAB传感器和阿霉素EAB传感器都显示了线性的pH响应曲线，这支持了pH传感特性可能是使用亚甲基蓝报告基因的EAB传感器的一个通用特征的结论。
2、 与组织培养板兼容的传感器
图3 细胞培养条件下传感器和无泄漏参比电极的表征
将EAB传感器集成到多孔培养板中还需要考虑到物理破坏细胞融合层的可能性。作者将这三个电极集成到24孔板的一个单孔（直径15.6mm）中，以提供更用户友好和标准化的组装，防止对细胞的损伤。用生物相容性的透明树脂制备了一个3D打印的传感器支架来固定三个电极。在中间打一个直径1厘米的孔，以便插入3D打印传感器支架。最后的培养板-传感器组件防止传感器和细胞单层之间的直接接触，从而避免传感器刮伤细胞层。
3、EAB传感器在流动介质中的性能及评估细胞代谢
图4 传感器系统中的细胞代谢测量
EAB传感器在流动介质中表现良好，确立了该传感器在灌注系统中使用的潜力。因此，可以评估其在实时评估细胞代谢中的有效性。细胞培养中的实时原位测量在3小时的平衡期后开始，并每小时持续72小时。EAB传感器的金电极每天被一个新鲜的金电极取代，每个功能化的金电极在浸入细胞培养基前进行校准。在MRC-5球状体中评估了EAB的效用，其细胞数比悬浮在相同体积的墨尔本介质中的A549单层高4倍。单层细胞培养pH在72 h时保持相对稳定，球状体在24 h时保持相对稳定，这是在细胞培养开始和结束时进行的pH论文测量独立证实的。相比之下，苯丙氨酸水平下降了，这反映了使用这种氨基酸来支持细胞代谢。与单层细胞相比，球状体显示出快速的苯丙氨酸清除率，而另一种单层培养的肿瘤细胞系MDA-MB-231（乳腺肿瘤）显示出与A549细胞系相似的苯丙氨酸清除率。作者比较了传感器衍生的苯丙氨酸测量与GC−质谱质谱分析。根据监测第1天（初始）苯丙氨酸浓度与第4天（最终）苯丙氨酸浓度的比值，EAB测量的比值为0.42，GC−MS测量的比值为0.40。同样，MRC-51天的MRC-5球状体显示低细胞毒性（乳酸脱氢酶（LDH）细胞毒性试验，占上清中总LDH的61 6.3%），没有明显的形态学差异。因此，该传感器在细胞培养中提供连续的pH和苯丙氨酸测量，具有稳定性和重现性，而没有细胞毒性。
结论：作者开发了一种小型的两用EAB传感器系统，可以嵌入传统的组织培养板中进行实时研究。该传感器可以在生理相关范围内同时测量pH和适配体-靶标苯丙氨酸，具有良好的精度和精度。该传感器在静态和流动培养基中功能良好。将无泄漏参考电极集成到我们的双用途EAB传感器系统中，提高了整个系统的稳定性、灭菌性和生物相容性。然而，该系统目前面临着与生物污染和长期稳定性相关的挑战，这必须在扩展应用中得到解决。应用琼脂糖水凝胶涂层可以通过提供一个防止生物物质积累的屏障来减轻生物污染。这种多路传感器技术可以扩展到多重适配体双用途EAB阵列，用于更全面地表征细胞培养中的培养基，包括芯片上的微生理系统和器官。
原文：Yang, Y., Gao, X., Widdicombe, B., Zhang, X., Zielinski, J. L., Cheng, T., Gunatilaka, A., Leung, K. K., Plaxco, K. W., Rajasekharan Unnithan, R., & Stewart, A. G. (2024). Dual-Purpose Aptamer-Based Sensors for Real-Time, Multiplexable Monitoring of Metabolites in Cell Culture Media. ACS nano, 18(38), 26127–26139. Advance online publication. https://doi.org/10.1021/acsnano.4c06813
来源：微生物安全与健康网，作者~陈诺。
