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根据《食品安全法》规定，国家卫生健康委、市场监管总局联合印发2025年第2号公告，发布50项新食品安全国家标准和9项修改单。其中微生物部分的标准包括：

（1）GB 4789.3《食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠菌群计数》（修订）
（2）GB 4789.38《食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠埃希氏菌计数》（修订）
（3）GB 4789.30《食品安全国家标准 食品微生物学检验 单核细胞增生李斯特氏菌检验》（修订）
（4）GB 4789.42《食品安全国家标准 食品微生物学检验 诺如病毒检验》 （修订）
（5）GB 31615.2《食品安全国家标准 食品用菌种安全性评价程序》（制定）

本文旨在通过对比2025版与2016版大肠菌群检验标准，清晰阐述修订的关键变更与发展趋势，以期帮助相关从业人员深入理解并掌握食品检验领域最新动向。该标准将取代GB4789.3—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠菌群计数》，其修订主要体现在五个方面。

1. 增加检测方法选择性（如均质器应用）
2. 完善特殊品类检测方案（乳制品专项）
3. 构建分级判定体系（典型/非典型菌落）
4. 建立容错处理机制（空白对照异常）
5. 强化标准可操作性（新增示例说明）

一、变化亮点

1、标准框架调整

a. 检验原理修订
• 删除原版“检验原理”章节
• 保留MPN法（最可能数法）原理说明
• 移除平板计数法原理描述

2、术语体系优化

• 细化“大肠菌群”等核心术语定义
• 删除"最可能数（MPN）基于泊松分布..."的数学理论描述
• 强化操作相关术语的实践指导性

3、实验设备与材料更新

a. 新增设备要求
• 30±1℃恒温培养箱（针对乳制品检测）
• 无菌接种环、无菌试管等耗材
• 大肠菌群计数测试片（4.8条款新增）

b. 设备参数调整
• 水浴箱温度由“46±1℃”扩展为“48±2℃”
• 取消菌落计数器的强制配备要求

4、检测流程优化

a. 培养时间调整
• BGLB肉汤培养时限由48±2h改为24-48h
• 复发酵实验建立24h/48h双观察节点

b. 操作方法改进
• 液体样品增加均质器振摇选项；
• 取消稀释过程"换用吸管吹打"的硬性规定；
• 规范初发酵实验操作表述。

5、大肠菌群平板法接种与培养的修改

a. 培养基处理
• 培养基保温温度同步调整为48±2℃

b. 乳制品检测规范
• 明确乳制品采用30±1℃培养（18-24h）
• 基于研究数据佐证温度调整的科学性

c. 菌落判定标准
• 细化典型/非典型菌落形态学特征
• 新增15-150CFU双稀释度处理规则（参照附录D）

6、结果处理更完善

a. 计算规则
• 细化空白对照异常处理方案
• 新增多场景计算结果修约规范

b. 报告标准化
• 增加示例说明不同检测情形的报告方式
• 强化与附录D的协同应用机制

二、详细对比

1、范围

本标准规定了食品中大肠菌群(Coliforms)计数的方法。 
本标准第一法适用于大肠菌群含量较低的食品中大肠菌群的计数，第二法适用于大肠菌群含量较高的食品中大肠菌群的计数。

2、术语和定义

2.1 大肠菌群 Coliforms

在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽孢杆菌。

2.2 MPN法 Most Probable Number(MPN) Technique（替换最可能数）

MPN法是统计学和微生物学结合的一种定量检测法。待测样品经系列稀释并培养后，根据其未生长的最低稀释度与生长的最高稀释度，应用统计学概率论推算出待测样品中大肠菌群的最可能数。

(原标准内容)

最可能数 Mostprobablenumber;MPN2.2
基于泊松分布的一种间接计数方法。

(删除了以下内容)

3、检验原理

3.1  MPN 法
MPN法是统计学和微生物学结合的一种定量检测法。待测样品经系列稀释并培养后，根据其未生长的最低稀释度与生长的最高稀释度，应用统计学概率论推算出待测样品中大肠菌群的最大可能数。3.2  平板计数法大肠菌群在固体培养基中发酵乳糖产酸，在指示剂的作用下形成可计数的红色或紫色，带有或不带有沉淀环的菌落。

3.2  平板计数法
大肠菌群在固体培养基中发酵乳糖产酸，在指示剂的作用下形成可计数的红色或紫色，带有或不带有沉淀环的菌落。

3、设备和材料

除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：
3.1 恒温培养箱：36 ℃ ±1 ℃、30 ℃ ±1 ℃（新增）。 
3.2 冰箱：2 ℃～5 ℃ 。 
3.3 恒温水浴箱：48 ℃±2 ℃ 。（原标准46 ℃±1 ℃） 
3.4 天平：感量 0.1 g。
3.5 均质器及无菌均质袋、均质杯，振荡器。 
3.6 无菌试管：15 mm×150 mm、18 mm×100 mm 或其他合适规格，以及小倒管（杜氏管）。（新增）
3.7 无菌吸管：1 mL（具 0.01 mL 刻度）、2 mL（具 0.02 mL 刻度）（新增）、5mL（具 0.05 mL刻度）（新增）、10 mL（具 0.1 mL 刻度）或微量移液器及无菌吸头。 
3.8 无菌锥形瓶：容量 500 mL。 
3.9 无菌培养皿：直径 90 mm。 
3.10 pH 计或精密 pH 试纸。 
3.11 无菌接种环：10 µL（直径约 3 mm）。（新增）
3.12 放大镜（新增）或菌落计数器

4、培养基和试剂

4.1 磷酸盐缓冲液：见 A.1。（原标准无菌磷酸盐缓冲液）
4.2 生理盐水：见 A.2。（原标准无菌生理盐水）
4.3 月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤：见 A.3。
4.4 煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤：见 A.4。
4.5 结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）：见 A.5。
4.6 1 mol/L NaOH：见 A.6。
4.7 1 mol/L HCl：见 A.7。
4.8 大肠菌群计数测试片(应以发酵乳糖产酸产气为阳性结果判断依据，且性能符合GB4789.28中相关培养基的质量要求)。 （新增）

第一法 大肠菌群MPN 计数法

5、检验程序

大肠菌群MPN计数的检验程序见图1。

图1 大肠菌群MPN计数法检验程序检验程序

主要修改点为BGLB肉汤培养时间由48 h±1 h改为24h~48h。

6、操作步骤

6.1 样品的稀释

6.1.1 固体和半固体样品：无菌操作称取 25 g 样品，放入盛有 225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，8 000 r/min～10 000 r/min 均质 1 min～2 min；或放入盛有 225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打 1 min～2 min，制成 1:10 的样品匀液。

6.1.2 液体样品：用无菌吸管吸取 25 mL 样品置于盛有 225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠），或放入盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min~2min，制成 1∶10的样品匀液。当样品不适宜进行体积取样时，按6.1.1操作。

6.1.3 必要时用 1 mol/L NaOH或 1 mol/LHCl，调节样品匀液的pH至6.5～7.5 之间。(调整了文字顺序，原标准内容样品匀液的pH应在6.5~7.5之间，必要时分别用1mol/L NaOH 或1mol/L HCl调节。)

6.1.4 用1mL 无菌吸管或微量移液器吸取 1:10 样品匀液 1 mL，沿管壁缓缓注入装有 9 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），将试管在振荡器上振荡混匀或换用1支1mL无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成 1:100 的样品匀液。

6.1.5 根据对样品污染状况的估计，参照6.1.4的操作，依次制成 10 倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释 1 次，换用 1 支1mL无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过 15 min。

6.2 初发酵试验

6.2.1 每个样品，选择 3 个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种 3 管 LST 肉汤，每管接种 1mL（如接种量超过 1 mL，则用双料 LST 肉汤）。从制备样品匀液开始至接种到 LST肉汤完毕，全过程不得超过15min。
将已接种样品的LST肉汤管置于 36℃±1℃培养24h±2h，检查产气情况。24h±2h小倒管或产气收集装置内有气泡产生，或轻轻振摇 LST肉汤管可见试管内有细密气泡不断上升者，判断为产气，产气者进行复发酵试验(确认试验)。如未产气则继续培养至 48h±2h再检查产气情况，产气者进行复发酵试验;培养至48h±2h，仍未产气者判断为大肠菌群阴性。若培养至 48h±2h，所有 LST肉汤管均未产气，按照附录 B中的 MPN检索表，报告每克(毫升)样品中大肠菌群的 MPN值，以 MPN/g(mL)表示 。

6.3  复发酵试验(确认试验)(原标准证实试验)

轻轻振摇各产气的LST肉汤管，分别用接种环取培养物1环，转种于BGLB肉汤管中，36℃±1℃培养24h±2h，检查产气情况，产气者判断为大肠菌群阳性；未产气者则继续培养至 48h±2h再检查产气情况，产气者判断为大肠菌群阳性，仍未产气者判断为大肠菌群阴性。（原标准36℃±1℃培养48h±2h，观察产气情况。产气者，计为大肠菌群阳性管。)

7、结果与报告（原标准大肠菌群最可能数(MPN)的报告）

根据复发酵试验中3个适宜连续稀释度中大肠菌群阳性的管数(如连续的稀释度超过3个，根据附录C确定最适的3个连续稀释度)，按照附录B中的MPN检索表，报告每克(毫升)样品中大肠菌群的MPN值，以MPN/g(mL)表示。（原标准按7.3确证的大肠菌群BGLB阳性管数，检索MPN 表(见附录B)，报告每g(mL)样品中大肠菌群的MPN 值。)

第二法 大肠菌群平板计数法

8、检验程序

大肠菌群平板计数法的检验程序见图 2。

图2 大肠菌群MPN计数法检验程序

检验程序主要修改点为新增大肠菌群测试片及新增乳及乳制品的培养温度要求。

9、操作步骤

9.1 样品的稀释

按 6.1 进行。

9.2 接种与培养

9.2.1 根据对样品污染状况的估计，选取 2个~3个适宜的连续稀释度的样品匀液(液体样品可以选择原液) ，每个稀释度接种2个无菌培养皿，每皿1mL。同时取磷酸盐缓冲液或生理盐水加入2个无菌培养皿作空白对照，每皿1mL。（原标准取1mL生理盐水加入无菌平皿作空白对照）

9.2.2 尽快将冷却至48 ℃±2℃的 VRBA倾水平静置待其凝固。从制备样品匀液开始至倾注VRBA完毕，全过程不得超过15min。琼脂凝固后，再均匀覆盖3m~4VRBA至整个平板表面。覆层的琼脂凝固后翻转平板，置于36℃±1℃培养18h~24h。对于乳及乳制品应置于30℃+1℃培养18h~24h。（原标准及时将15mL~20mL融化并恒温至46℃的结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)约倾注于每个平皿中。小心旋转平皿（避免摇出培养基），将培养基与样液充分混匀，待琼脂凝固后，再加3mL~4mLVRBA 覆盖平板表层。翻转平板，置于36℃±1℃培养18h~24h。）

9.2.3 若采用大肠菌群计数测试片，则按其说明进行操作。（新增）

9.3 平板菌落数的选择

9.3.1 观察并计数菌落，必要时用放大镜或菌落计数器。选取所有菌落数在15CFU~150CFU之间的平板，分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落。典型菌落为红色至紫红色，菌落周围可带有红色沉淀环，菌落直径一般大于0.5mm。可疑菌落为红色至紫红色，菌落直径一般小于0.5mm。（原标准典型菌落为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环，菌落直径为0.5mm或更大，最低稀释度平板低于15CFU 的记录具体菌落数。）

9.3.2 若有2个稀释度的平板菌落数在15CFU~150CFU之间以及其他情形的菌落数选择，按附录D的规定执行。（新增）

9.4 确认试验（原标准证实试验）

从同一稀释度的 VRBA平板上挑取典型和可疑菌落各5个，典型或可疑菌落少于5个者，则挑取其全部菌落。每个菌落接种1支BGLB肉汤管，36℃±1℃培养24h±2h，检查产气情况，产气者为大肠菌群阳性;未产气者则继续培养至 48h±2h再观察，产气者为大肠菌群阳性，仍未产气者为大肠菌群阴性。
（原标准从VRBA 平板上挑取10个不同类型的典型和可疑菌落，少于10个菌落的挑取全部典型和可疑菌落。分别移种于BGLB肉汤管内，36℃±1℃培养24h~48h，观察产气情况。凡BGLB肉汤管产气，即可报告为大肠菌群阳性。）

10、结果计算与报告 

10.1 所选稀释度的典型菌落数以及可疑菌落数与各自大肠菌群阳性率的乘积之和的平均值，乘以稀释倍数，为大肠菌群的菌落数。大肠菌群的菌落数小于100CFU时，按“四舍五入”的原则修约，以整数报告。大肠菌群的菌落数大于或等于100CFU时，第3位数字采用“四舍五入”原则修约后，取前2位数字，后面用0代替位数;也可用10的指数形式来表示，按“四舍五入”原则修约后，保留两位有效数字。附录D规定了大肠菌群菌落数的计算、数值修约和结果报告的方式，并给出了相关示例。

10.2 若空白对照上有菌落生长，则此次检验结果无效。

10.3 称重取样以CFU/g为单位报告结果，体积取样以CFU/mL为单位报告结果。

（原标准经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以9.3中计数的平板菌落数，再乘以稀释倍数，即为每g(mL)样品中大肠菌群数。例:10^-4样品稀释液1mL，在VRBA 平板上有100个典型和可疑菌落，挑取其中10个接种BGLB肉汤管，证实有6个阳性管，则该样品的大肠菌群数为：100×6/10×10⁴/g(mL)=6.0×10⁵CFU/g(mL)。若所有稀释度(包括液体样品原液)平板均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数计算。）

来源：“食品微生物检测”公众号，作者~食品微生物检测！
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