一种基于铕离子磁捕获和荧光传感的检测致病细菌方法
发布时间：2024-09-20 浏览次数：102
由食源性致病细菌引起的疾病一直是人类面临的重大威胁。许多人因致病细菌感染而生病或死亡。常见的食源性致病菌包括金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、粪肠球菌、鲍曼不动杆菌、蜡样芽孢杆菌和铜绿假单胞菌。这些病原体通常存在于复杂的样本中。传统方法使用耗时的过夜培养，然后进行生物检测。为了预防食源性致病菌引发的爆发，开发能够快速分离和检测复杂样本中致病细菌的分析方法非常重要。
磁性纳米颗粒（magnetic nanoparticles, MNPs）由于其磁性特性，可用于从复杂样本中富集和分离目标细菌，从而避免了耗时的过夜细菌培养。铁氧化物MNPs通常与不同的金属氧化物、聚合物、适配体、抗体、蛋白质、葡萄糖、肽和抗生素等进行修饰，以作为亲和探针靶向细菌。磁性金属离子，如Fe³⁺、Co²⁺、Ni²⁺和Gd³⁺，通过锚定在细菌表面上，使革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌具有磁性。由于细菌表面含有作为硬路易斯碱的含氧官能团，根据硬软酸碱理论，这些磁性金属离子作为硬酸或边界酸与细菌表面结合。磁性金属离子与细菌复合物具有高密度的磁性金属离子，可以通过简单放置外部磁体来轻松分离。
Eu³⁺作为一种生物传感探针，由于其荧光特性，已被广泛用于检测各种目标分析物。Eu³⁺还表现出顺磁性，这使其成为磁性探针的潜在候选者。此外，Eu³⁺作为硬酸与含氧官能团具有高亲和力。尽管Eu³⁺作为磁性探针用于细菌捕获尚未有报道，但其独特的荧光和磁性使其成为一种检测细菌的潜在工具。
近日，台湾阳明交通大学应用化学系Yu-Chie Chen团队在Analytical Chemistry期刊上发表了题为：Europium Ion-Based Magnetic-Trapping and Fluorescence-Sensing Method for Detection of Pathogenic Bacteria的论文。
为了解决该问题，该研究旨在开发一种利用Eu³⁺的荧光和磁性双重功能检测致病细菌的快速传感方法。实验中使用了Eu³⁺乙酸盐作为磁性探针，并通过与四环素（tetracycline, TC）结合增强其荧光。使用的细菌包括革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌，分别在特定培养基中培养。利用外部磁铁实现磁性分离，随后通过荧光光谱和MALDI-MS分析捕获的细菌。
首先使用了革兰氏阳性细菌（金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、蜡样芽孢杆菌）和革兰氏阴性细菌（铜绿假单胞菌、大肠杆菌J96、鲍曼不动杆菌）作为模型样品，研究了Eu³⁺是否可以用作磁捕集探针。图1A显示了仅含有Tris缓冲液的Eu³⁺溶液的照片，而图1B显示了金黄色葡萄球菌通过Eu³⁺捕集后经过磁性分离的照片。在每个样品瓶的右侧放置了一个磁铁。仅含有Eu³⁺的样品中未观察到沉淀或磁性复合物，但在含有Eu³⁺-细菌复合物的样品中，瓶子靠近磁铁的一侧可见明显的白色斑点（红色圆圈标出）。其他模型细菌与Eu³⁺混合后也观察到了类似现象。这些结果表明，Eu³⁺可以用作捕集探针，用来磁性分离这些模型细菌。此外，Eu³⁺-细菌复合物显示出显著增加的磁性，使其在放置外部磁铁后更易于聚集。
图2 磁性Eu³⁺-细菌复合物的检测。(A) 图为仅含有pH 8的Tris缓冲液（0.39 mL）的空白样品照片，(B) 图为加入Eu³⁺（75 mM, 10 μL）处理后制备的金黄色葡萄球菌样品（0.39 mL, 0.5 mg/mL）的照片。样品在微波炉中加热（功率：180 W，时间：2.25 min）后，通过外部钕磁铁（约4000 G）进行磁性分离。照片在常规光照条件下拍摄。红色椭圆标记了磁性Eu³⁺-细菌复合物的位置。
进一步研究了该方法是否适用于定量分析。以金黄色葡萄球菌为模型细菌，研究了不同细菌浓度下的荧光强度变化。根据校准曲线，金黄色葡萄球菌的检测限为约3.5×10⁴ CFU/mL。
图3 定量分析。(A)-(C)使用Eu3+ (75 mM, 10 μL) 作为捕获探针，然后进行冲洗、漂白处理 (0.0625 %) 和添加 TC (30 μM, 30 μL)，获得含有不同浓度金黄色葡萄球菌的样品 (0.39 mL) 的荧光光谱 (λex= 394 nm)。进行了三次重复。浓度为1 mg mL-1的金黄色葡萄球菌相当于7.86*109 CFU mL-1。
此外，研究了可能存在于真实样品中的干扰物质对传感结果的影响。干扰物质包括钾、钠、镁、钙等离子，以及葡萄糖、蔗糖、苹果酸和抗坏血酸等。通过实验分析，发现某些干扰物质（如Mg²⁺和抗坏血酸）会影响传感结果，降低荧光强度；而苹果酸则会增强荧光强度。然而，当所有干扰物质同时存在时，整体干扰效应很低，说明正负效应相互抵消。
图4 干扰物质对检测结果的影响。柱状图显示了荧光强度（616 nm）测试的汇总结果。灰色柱表示含有蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus，0.2 mg/mL）和干扰物质的样品，蓝色柱表示仅含有干扰物质的样品。所有样品都在Tris缓冲液（pH 8）中制备，加入了Eu³⁺（75 mM, 10 μL）作为捕集和传感探针，随后进行漂白剂处理并加入四环素（TC, 30 μM, 30 μL）。
研究人员进一步验证了该方法在模拟真实样品中的应用。向500倍稀释的苹果汁中加入五种不同浓度的蜡样芽孢杆菌，使用本方法进行捕获和感应。图3A显示了得到的荧光光谱，并根据荧光光谱在616 nm处的强度与样品中添加的蜡样芽孢杆菌的浓度的关系得出图3B。因此，估计样品中的蜡状芽孢杆菌浓度为499 ng mL−1，接近加标浓度500 ng mL−1。
图5 使用标准加入法定量分析苹果汁样品中的蜡样芽孢杆菌。（A）使用我们的捕获和传感方法后获得的含有蜡样芽孢杆菌（500 ng mL−1）的苹果汁样品的代表性荧光光谱，其中添加了不同浓度的蜡样芽孢杆菌。进行了三次重复。（B）根据图（A）中的结果得出的相应图。
综上所述，通过消除耗时的过夜培养步骤，该研究首次报道了Eu³⁺可以作为捕集和传感探针双重功能的材料用于检测细菌。通过使用外部磁铁，Eu³⁺-细菌复合物能够在样品溶液中轻松分离，同时金黄色葡萄球菌的检测限达到了10⁴ CFU/mL。该方法的关键优势在于其简单性和快速性，使其成为潜在的便捷检测工具。其快速筛选能力为快速高效识别细菌的存在打开了新的可能性，这在保护公共健康和食品安全方面至关重要，尤其是细菌污染对公共卫生构成显著威胁。
此外，该方法还可以扩展应用于真菌和病毒的检测。该方法已经展现了在检测黑曲霉孢子和慢病毒方面的潜在应用，结果表明与空白样品相比，黑曲霉孢子和慢病毒的颜色明显不同。然而，仍需进一步探索优化实验条件，以评估该方法对其他实体（如真菌和病毒）的敏感性。
论文来源：https://doi.org/10.1021/acs.analchem.4c00655
来源：微生物安全与健康网，作者~段子璇。
