工程院食品安全院士团队

科研成果转化平台

一、操作流程

1. 准备工作

标记试管
用油性记号笔在斜面试管外壁标注：菌种名称、接种日期、操作者姓名（避免使用易脱落的标签）。
若使用预灭菌试管，检查封口是否完好，避免污染。

无菌环境准备
用75%酒精擦拭超净工作台台面、双手及工具表面。
点燃酒精灯，操作区域限制在火焰周围10-15cm范围内（无菌区）。
准备菌种管和空白斜面试管，左手持两管，斜面朝上呈30°角（菌种管在前，便于快速操作）。

2. 工具灭菌与试管处理

接种工具灭菌
右手持接种环（针），将金属部分垂直置于酒精灯外焰烧至红热（持续3-5秒），冷却后使用。
注意：若使用带塑料柄的接种环，避免火焰直接接触塑料部分。

松动棉塞：在火焰旁轻轻旋转两试管的棉塞，使其易于快速拔出。

3. 取菌与接种操作

试管口灭菌：左手持两试管，右手小指与无名指夹住棉塞拔出，试管口短暂过火焰（2-3秒）灭菌。

取菌技巧
冷却后的接种环轻触菌种管空白培养基区域（如无冷凝水，可轻触内壁降温）。
挑取单菌落边缘菌苔（避免挑取过厚或老化的菌体），动作轻快，防止高温损伤菌种。

划线接种
接种环与斜面角度：40°-45°
划线力度：轻触表面，避免划破琼脂（划痕可能导致杂菌滋生）。
划线密度：若需单菌落，采用四区划线法（每区后灼烧接种环）。
将菌种转移至空白斜面，从底部向管口方向划“Z”形线（如图示）。

关键参数：

4. 封管与工具处理

封管灭菌
接种后试管口再次过火焰，迅速塞紧棉塞（避免火焰烧焦棉塞）。
若使用硅胶塞或螺旋盖，需在火焰旁旋紧。

工具二次灭菌：接种环先在火焰上灼烧至残留菌体碳化（防止飞溅），再彻底烧红灭菌。

5. 培养条件

温度与时间

其他参数
湿度：保持培养箱湿度60-70%（防止培养基脱水）。
避光：对光敏感的菌种需用锡箔纸包裹试管。

二、关键注意事项与问题解决

1. 无菌操作核心原则

三不原则：
棉塞不碰桌面（始终夹在手指间）。
试管口不对空气开放（火焰旁操作）。
灭菌工具不接触未灭菌表面。

污染应急处理：若发现培养基浑浊或异味，立即高压灭菌（121℃, 20分钟）后丢弃。

2. 常见问题与优化

3. 特殊菌种操作

厌氧菌：使用厌氧罐或抽换气系统，培养基中添加还原剂（如半胱氨酸）。

病原菌：在生物安全柜中操作，穿戴防护服及手套，废弃物需高压灭菌。

三、操作后管理

菌种保存：
短期保存：4℃冷藏，普通细菌可存活1-3个月。
长期保存：甘油冻存管（-80℃）或真空冷冻干燥。

记录与标记：详细记录菌种传代次数、培养基批次及培养结果。

通过严格执行上述步骤，可显著提高斜面接种成功率，减少污染风险，为后续实验提供可靠菌种来源。